作者: 胡功平, 周业明, 牟丹, 曲娇娇, 罗莉, 段琳, 徐忠顺, 邹晓

摘要: 蝉花是一种具有悠久药用历史的昆虫病原真菌。本研究旨在探讨蝉花菌膜的作用。结果表明，蝉花菌膜具有一定的氮转运能力，能够将氮从昆虫体内转运到外部环境，并将环境中的氮转运到蝉花中。通过研究菌膜对细菌的过滤作用，发现蝉花菌膜能够过滤掉环境中的大部分细菌。利用高通量测序方法，我们发现蝉花生长发育过程中细菌群落的丰度先增加后减少。在无菌玻璃瓶中培养的蝉花菌膜的细菌丰富度和多样性显著低于土壤覆盖培养的蝉花菌膜。此外，本研究还发现，土壤覆盖培养和无菌玻璃瓶培养下形成的蝉花菌膜均具有疏水性。无菌玻璃瓶培养的蝉花菌膜排列紧密有序，而土壤培养的蝉花菌膜则相反。无菌玻璃瓶培养的蝉花菌膜密度和厚度高于土壤覆盖培养的菌膜，但干重/鲜重低于土壤覆盖培养的菌膜。

重要性: 在蝉花的自然生长过程中，它会形成由菌丝特化而成的菌膜结构。我们发现蝉花菌膜不仅能够过滤环境中的细菌，还能够吸收和转运蝉花体内外的氮元素。这些发现对于理解蝉花维持内部微生物群落的稳定机制以及蝉花如何维持自身营养平衡具有重要意义。此外，本研究还丰富了我们对蝉花在不同生长阶段细菌群落组成及相关功能的理解，这对于理解蝉花真菌感染宿主后的环境适应机制、元素分布网络以及共生微生物系统的变化过程具有重要价值。同时，本研究也为蝉花真菌的一些重要生态模拟栽培技术提供了理论依据。

关键词: 蝉花, 细菌群落, 菌膜形态, 氮转运, 选择性过滤

引言

蝉花是由蝉花真菌寄生在蝉类昆虫上形成的寄生复合体。蝉花由五个部分组成，分别是子座、孢子粉、菌膜、昆虫体壁和内部菌核（图1），其生长发育与其生境密切相关。蝉花首次记载于南北朝时期雷敩所著的《雷公炮炙论》，比冬虫夏草早了800年。中国学者李增智发现了蝉花的有性型，并将其归类为蝉花属的新种，命名为蝉花（Cordyceps chanhua）。作为一种传统中草药，蝉花含有多种有效成分，如核苷、麦角固醇、多糖、虫草酸、多球蛋白、氨基酸和脂肪酸等。在药用价值方面，蝉花具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫调节、保护肾功能、抗衰老、抗疲劳、降血糖等药理作用。作为一种昆虫病原真菌，蝉花对多种农业害虫具有致病性，包括鳞翅目、同翅目和半翅目害虫，如小菜蛾、温室白粉虱、台湾乳白蚁和蚜虫等。此外，蝉花在日常生活中也有广泛应用，早期研究发现蝉花对洗煤废水具有高效絮凝作用。

蝉花的人工栽培技术包括液体发酵、固体培养、虫体培养和生态覆盖土壤培养。其中，虫体培养和生态覆盖土壤培养的蝉花虫体部分和子实体部分可以收获，并且外观特征与野生蝉花相似，因此更受欢迎。我们之前的研究发现，仿生土壤覆盖培养的蝉花中几种主要活性物质的含量与野生蝉花相似。因此，从活性成分的角度来看，土壤覆盖培养的蝉花可以替代野生蝉花。

目前，大多数关于蝉花形态特征的研究集中在蝉花的菌丝、菌核、子座和子囊结构上。然而，作为蝉花与外部环境的接触面，菌膜的形态特征尚未有报道。先前的研究发现，蝉花菌核中其他真菌的相对丰度较低，而细菌群落相对丰富。菌膜是蝉花与环境的界面，而昆虫病原真菌菌膜的微生物群落丰富度显著高于内部菌核和菌圈土壤。因此，探索蝉花菌膜对细菌群落的生物过滤作用是本研究的重点之一。

在本研究中，我们通过高通量测序分析了不同生长阶段和不同培养环境下蝉花内部菌核和菌膜的细菌群落，并分析了蝉花菌膜对细菌群落的过滤作用。此外，我们还分析了蝉花菌膜的氮转运功能。

结果

不同生长阶段蝉花菌核和菌膜的细菌微生物多样性

Alpha多样性分析

稀释曲线分析发现，随着样本序列数量的增加，Shannon-Wiener曲线趋于平缓，表明测序数据量合理，测序深度能够覆盖样本细菌群落的大部分微生物多样性信息（图S1）。经过优化，本次测序在27个样本中检测到2,112,984条有效序列，总碱基数为898,572,190。每个样本的序列长度为40,387–90,034，平均序列长度为425 bp。优化后的序列通过97%的一致性进行OTU聚类，共检测到3,850个OTU，涵盖1,785个物种、953个属、429个科、41个门、101个纲和202个目。

不同样本的α多样性指数比较分析显示，每个样本的覆盖率指数均超过99%，表明本次测序数据能够充分反映蝉花菌核和菌膜中细菌群落的多样性（表1）。无菌玻璃瓶和土壤覆盖培养的蝉花菌核在不同培养阶段的Ace和Chao指数分别为90,059–414,584和66,074–409,652，表明不同培养环境下蝉花菌核的细菌群落结构相似。土壤覆盖培养的蝉花菌核在菌膜形成阶段和成熟阶段的Ace和Chao指数分别为338,996–414,584和299,156–409,652，显著高于无菌培养的蝉花菌核（P < 0.05）。从表1可以看出，土壤覆盖培养的蝉花菌膜的细菌丰富度和多样性显著高于无菌培养的蝉花菌膜，表明不同培养环境对蝉花菌膜的细菌群落组成和多样性有较大影响。

Beta多样性分析

PCoA分析显示，Si_1与其他内部菌核样本的距离较远，表明蝉花僵化阶段的菌核细菌群落组成与其他阶段显著不同（图2）。无菌培养的蝉花菌核（Si_2和Si_3）和菌膜样本（Ci_2和Ci_3）分别聚集在一起，而土壤覆盖培养的蝉花菌核样本（Ss_2和Ss_3）在各个阶段分散，表明不同培养环境下蝉花菌核的细菌群落组成差异较大。

不同培养阶段相同环境下的OTU共享分析

Venn图分析显示，无菌玻璃瓶培养的蝉花在不同培养阶段的菌核和菌膜样本中检测到的OTU数量分别为264、552、87、170和534（图3A）。分析发现，蝉花三个阶段的菌核和菌膜中分别有47和35个OTU始终存在，表明这些细菌伴随蝉花的整个生长发育过程。随着蝉花的生长发育和菌膜的形成，菌核中的细菌数量逐渐减少，而菌膜中的细菌数量显著增加，推测部分细菌可能从菌核迁移到菌膜中。

不同培养环境下相同阶段的OTU共享分析

Venn图分析显示，菌膜形成阶段无菌培养的蝉花菌核和菌膜中分别检测到552和87个OTU，而土壤覆盖培养的蝉花菌核和菌膜中分别检测到1,142和2,097个OTU（图4A）。成熟阶段无菌培养的蝉花菌核和菌膜中分别检测到170和543个OTU，而土壤覆盖培养的蝉花菌核和菌膜中分别检测到942和1,619个OTU（图4B）。结果表明，不同培养环境下蝉花菌核和菌膜的细菌群落组成差异较大。

蝉花样本中细菌群落的常见属

在属水平上，绘制了所有蝉花样本细菌群落的饼图（图5A），结果显示所有样本中共有22个属，包括无色杆菌（Achromobacter）、沙雷氏菌（Serratia）、假单胞菌（Pseudomonas）、肠球菌（Enterococcus）、芽孢杆菌（Bacillus）等（图5B）。这些细菌在所有样本中均被检测到，表明它们参与了蝉花的整个生长发育过程。

菌膜的疏水性

无菌玻璃瓶和土壤覆盖培养的蝉花菌膜的水接触角均大于90°（表2），表明两种环境下蝉花菌膜均具有疏水性。无菌培养的蝉花菌膜的疏水性显著强于土壤覆盖培养的蝉花菌膜，表明蝉花在不同环境下能够调节其疏水性以适应环境。

菌膜的重量和厚度

土壤覆盖培养的蝉花菌膜的鲜重/干重显著高于无菌玻璃瓶培养的蝉花菌膜（表3）。然而，土壤覆盖培养的蝉花菌膜厚度较小，可能是由于菌膜形成过程中粘附或包裹了一些小土壤颗粒，导致质量较大。而无菌培养的蝉花菌膜在玻璃瓶中生长不受限制，因此菌膜厚度较大。

菌丝的排列和结构

扫描电镜观察显示，无菌培养和土壤覆盖培养的蝉花菌膜排列差异较大（图7）。无菌培养的蝉花菌膜菌丝排列紧密有序（图7A–C），而土壤覆盖培养的蝉花菌膜菌丝排列较为松散无序（图7G–I）。此外，无论哪种环境，蝉花菌膜大多通过H型菌丝桥连接（图7D–F, J, L）。

菌丝密度

土壤覆盖培养的蝉花菌膜的平均菌丝数量为17.33，密度为0.01289；无菌玻璃瓶培养的蝉花菌膜的菌丝数量为25.67，密度为0.01909（表4）。方差分析显示，无菌培养的蝉花菌膜菌丝密度显著高于土壤覆盖培养的菌膜。

蝉花菌膜对细菌的过滤作用

有趣的是，我们发现土壤原液（S0）涂布后，平均单菌落总数为275.00 CFU/mL，而600目尼龙网过滤液（S1）的平均单菌落总数为148.33 CFU/mL（表5），显著低于土壤原液。这可能是因为部分细菌被尼龙网过滤或吸附，导致细菌数量显著减少。然而，涂布培养菌膜过滤的土壤悬浮液（S2）后，仅生长了少量单菌落，平均值为3.33 CFU/mL，表明大部分细菌未能通过菌膜。无菌水滤液（Sck）中未生长任何单菌落，排除了菌膜中细菌的影响。从培养基中微生物的生长情况也可以看出，细菌数量为S0 > S1 > S2 > Sck。

蝉花菌膜能够转运氮

15N在昆虫、菌膜和土壤中的分布和流动方向

接种L-谷氨酰胺-15N + 分生孢子悬浮液后，僵化虫体内的总氮含量为10.16%，15N的原子百分比为0.3785%（表S1）。土壤覆盖培养后，后期形成的菌膜中总氮含量为8.12%，并且在菌膜和未标记的土壤中均检测到15N，表明蝉花能够随着菌膜的形成将15N从昆虫体内转运到外部环境。尽管处理组和对照组土壤中的15N含量无显著差异，但处理组土壤中的氮含量高于对照组，表明蝉花菌膜的存在促进了氮的转运。

土壤15N在土壤、菌膜和昆虫中的分布和流动方向

L-谷氨酰胺-15N处理的土壤中15N的原子百分比为0.4003%（表S2）。接种蝉花并覆盖土壤后，土壤中15N的百分比显著降低至0.3765%，表明土壤中的15N明显转移，并且在菌膜和内部菌核样本中检测到15N，证明蝉花在生长过程中吸收了土壤中的氮，且菌膜中的15N含量显著高于内部菌核样本，表明蝉花主要通过菌膜吸收营养物质以维持自身菌膜的生长和繁殖。

讨论

接触角是衡量表面疏水性、表面能、异质性和粗糙度的常用指标。Chau等人评估了真菌的水接触角大于90°，表明真菌具有疏水性；接触角越大，疏水性越强。本研究结果表明，无菌培养和土壤覆盖培养的蝉花菌膜接触角均大于90°，表明蝉花菌膜具有疏水性，这是其生存和适应环境的关键。真菌的表面疏水性使其能够更好地吸附有机物质，这可以作为影响真菌在异质介质中粘附和转运的表面特性之一。真菌通过产生菌丝网络繁殖，并分泌酶将复杂营养物质降解为单糖以维持细胞生长。疏水蛋白的分泌能够显著降低表面张力，使菌丝能够从液体中脱离并生长到空气中。真菌表面疏水蛋白参与了真菌生长发育的多种功能，并帮助分生孢子粘附在昆虫表皮上，这在绿僵菌和白僵菌中已有报道。

通过扫描电镜观察，可以看出无菌培养的蝉花菌膜排列紧密，而土壤覆盖培养的蝉花菌膜排列较为松散无序。这是因为土壤覆盖的蝉花在土壤中生长时受到一定的阻力，而无菌培养的蝉花可以在空气中自由生长。先前的研究观察到冬虫夏草菌膜菌丝之间存在H型菌丝融合。有趣的是，我们在蝉花菌丝中也观察到了大量的H型菌丝融合。因此，昆虫病原真菌的菌丝中存在大量的H型菌丝融合，而H型菌丝融合通常与准性生殖密切相关。准性生殖广泛存在，是真菌的一种特殊繁殖模式，也是真菌遗传变异的重要来源。通过准性生殖，个体之间的遗传物质可以相互交流，这比有性生殖更容易使真菌获得并建立种群优势。在复杂环境中，真菌菌膜的形成受到许多因素的影响，如附着表面的粗糙度、环境因素、疏水性等。在本研究中，我们通过扫描电镜观察了蝉花菌丝的排列并计算了其菌丝密度。研究结果表明，无菌培养的蝉花菌膜菌丝排列紧密，菌丝生长密度大于土壤覆盖培养的蝉花菌膜。而土壤覆盖培养的蝉花菌丝排列较为松散无序，密度较小，推测这与生长环境有关。土壤覆盖的蝉花在土壤中生长时受到一定的阻力，而无菌培养的蝉花可以在空气中自由生长，因此菌丝排列紧密。未来我们可以继续探索不同环境因素对蝉花菌膜形成的影响，这将有助于我们理解蝉花对环境的适应机制，并促进蝉花的生态模拟栽培。

本研究发现，不同培养环境对蝉花细菌群落的组成和多样性有较大影响，表明外部微生物因素对昆虫病原真菌细菌群落组成的影响较大。分析了所有蝉花样本的常见属，常见细菌包括无色杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌、肠球菌和芽孢杆菌等22个属，表明这些细菌群在蝉花的生长发育中发挥了重要作用，这些细菌群在野生蝉花样本中也有发现。先前的研究报道，微生物之间的竞争可以促进新活性物质的产生或增加现有代谢物的含量。例如，蝉花与Cedecea、沙雷氏菌和肠球菌共培养后，HEA的产量显著增加。此外，研究表明沙雷氏菌不仅具有抗菌活性，还对一些昆虫叶片具有致病性，因此推测这类细菌可能参与了蝉花感染宿主的过程。

在本研究中，我们发现随着蝉花的生长，菌膜中检测到的OTU越来越多。据报道，细菌可以借助真菌菌丝移动，因此推测菌膜中的部分细菌可能来自内部菌核。作为蝉花与环境的界面，菌膜是直接接触的。我们发现，当蝉花成熟时，菌膜上的细菌群落高于内部菌核。因此，推测菌膜可能作为屏障，防止外来细菌进入内部菌核，从而起到保护蝉花的作用。基于此，我们使用蝉花菌膜作为过滤介质过滤土壤细菌，并验证了其对细菌的生物过滤作用。根据我们的结果，菌膜过滤的土壤悬浮液涂布培养后仅生长了少量细菌，表明菌膜能够过滤掉土壤中的大部分细菌。据报道，大量环境细菌定殖在蝉花菌膜表面。尽管蝉花菌膜生长在复杂的土壤环境中，但它们能够保护自己免受外部病原体的侵害，这与菌膜的特性有关。这种具有类似特性的菌根鞘结构可以通过吸收和储存营养物质、有效隔离病原体来增强宿主植物的抗病性和抗逆性。我们首次发现蝉花菌膜对土壤细菌具有生物过滤作用，这有助于理解蝉花内外环境中微生物之间的关系，对蝉花栽培具有重要意义。

众所周知，植物可以通过昆虫病原真菌从植食性昆虫中获取氮，Behie等人发现绿僵菌、白僵菌和蜡蚧轮枝菌都表现出将氮转运给植物的能力。此外，据报道，罗伯茨绿僵菌在感染蜡螟幼虫后，可以将氮从蜡螟幼虫转移到柳枝稷植物中进行固氮。有趣的是，菌丝不仅可以将氮从昆虫体内转运到外部环境，还可以将氮从土壤转运到昆虫体内。据报道，昆虫病原真菌蝉花与菌根真菌密切相关，后者可以转运氮。先前的研究发现，昆虫病原真菌的菌膜菌丝可以从昆虫体内转运营养物质，昆虫病原真菌还可以将受感染昆虫体内的氮转运给植物。一些昆虫病原真菌，如绿僵菌、白僵菌和樱桃轮枝菌，具有转运氮的能力。据报道，植物可以通过与内生昆虫病原真菌结合获得昆虫氮源。Behie和Bidochka表明，所有绿僵菌和白僵菌菌株都可以将大量昆虫来源的氮转运给植物。蝉花富含氮，在其生长发育过程中，它会将体内多余的氮排出体外，以确保正常生长。

总之，本研究首次验证了蝉花菌膜对细菌的过滤作用和对氮的转运功能。在未来的研究中，我们将进一步探索蝉花能够过滤哪些微生物以及转运氮的具体形式。这将有助于理解蝉花的元素网络分布机制，并为蝉花的生态栽培技术提供理论依据。

结论

我们的研究首次证明，土壤覆盖培养和无菌玻璃瓶培养的蝉花菌膜具有疏水性。此外，蝉花菌膜不仅对土壤细菌具有生物过滤功能，还对昆虫体内和土壤中的氮元素具有转运功能。