蝉拟青霉液体培养条件优化

艾仁丽1 ，谭艾娟1* ，吕世明2*

 ( 1.贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院，山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室， 山地生态与农业生物工程协同创新中心，贵州贵阳550025; 2.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025)

摘要：［目的］建立能够有效提高蝉拟青霉液体培养效率的培养体系，增加其生物量。［方法］以蝉拟青霉生物量作为响应值，通过Plackett - Burman实验设计从8个试验影响因素中筛选出3个主要影响因素，基于3因素3水平的Box - Behnken设计法以及响应面分析法研究影响蝉拟青霉液体培养各因素之间的交互作用。［结果］通过Plackett - Bur man设计法确定影响最为显著的因素为接种量、pH和温度，利用最陡爬坡试验确定最佳范围在接种量7%、pH 6. 00、 温度25 ℃附近，借助Box - Behnken设计法最终确定最佳液体培养条件为：葡萄糖20 g / L、蛋白胨3 g / L、酵母膏2 g / L、KH2 PO4 1 g / L、MgSO4 0. 5 g / L、接种量6. 65%、pH 6. 00、温度24. 01 ℃。优化后的培养体系所培养的蝉拟青霉其生物量从优化前的147. 106 0 g / L提高到239. 475 3 g / L，提高了62. 79%。［结论］优化后的培养体系能够有效提高蝉拟青霉生物量，该方法对于优化蝉拟青霉生物量发酵条件是一种有效、可行的方法。

关键词：蝉拟青霉;真菌培养;生物量;液体深层培养;响应面

中图分类号： Q512 文献标识码： A DOI： 10. 16519 / j. cnki. 1004-311x. 2020. 04. 0063

Optimization of liquid culture conditions of Paecilomyces cicadae

AI Ren - li1 ，TAN Ai - juan1* ，LV Shi - ming 2*

( 1. Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region( Ministry of Education) ，Collaborative Innovation Center for Mountain Ecology ＆ Agro - Bioengineering( CICMEAB) ，College of Life Sciences / Institute of Agro - bioengineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China; 2. College of Animal Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China) 

Abstract： ［Objective］To establish a culture system that can effectively improve the liquid culture efficiency of Paecilomyces cicadae and increase its biomass. ［Method］Using Paecilomyces cicada biomass as the response value，three main influencing factors were selected from the eight experimental influencing factors through the Plackett - Burman experimental design，and then the Box - Behnken design method with 3 factors and 3 levels and response surface analytical methods were used to study the interaction between various factors affecting the liquid culture of Paecilomyces cicadae.［Result］The Plackett - Burman de sign method was used to determine the most influential factors were inoculation volume，pH and temperature. The steepest climbing test was used to determine the optimal range to be around 7% inoculation volume，pH 6. 00 and temperature 25 ℃ . Box - Behnken design method finally determined the best liquid culture conditions： glucose 20 g / L，peptone 3 g / L，yeast extract 2 g / L，KH2 PO4 1 g / L，MgSO4 0. 5 g / L，inoculation amount 6. 65% ，pH 6. 00，temperature 24. 01 ℃ . The biomass of Paecilo myces cicadae cultured by the optimized medium increased from 147. 106 0 g / L before optimization to 239. 475 3 g / L，an in crease of 62. 79% .［Conclusion］ The optimized culture system can effectively improve the biomass of Paecilomyces cicadae，in dicating that this method is a feasible method for optimizing the fermentation conditions of Paecilomyces cicadae biomass.

Keywords： Paecilomyces cicadae; fungal culture; biomass; liquid deep culture; response surface

收稿日期： 2020 - 04 - 21

基金项目：国家自然科学基金项目( 31760749) ;贵州省科技计划项目(黔科合平台人才［2017］5788号)

作者简介：艾仁丽( 1997 - ) ，女，硕士研究生，研究方向：生物工程，发表论文1篇，获国家三等奖1项、专利1项，E - mail： 1565111084 @qq. com。

*通讯作者：

谭艾娟( 1963 - ) ，女，硕士，教授，硕导，研究方向：生物化学与分子生物学，发表论文40余篇，E-mail：772771868@ qq. com。

吕世明( 1963 - ) ，男，博士，教授，硕导，研究方向：兽医药理学与毒理学，发表论文60余篇，E-mail：lvlvsm@ 163. com。

蝉花是我国的一种传统中药材，是蝉拟青霉 ( Paecilomyces cicadae)寄生于蝉若虫后形成的虫菌复合体，在化学成分与药用功效上与冬虫夏草极为相似，蝉拟青霉与冬虫夏草的无性型同属［1］。1982 年从蝉若虫虫尸上分离纯化得到一个菌株，后在 Samson专著中鉴定为蝉拟青霉［2］，蝉拟青霉胞内含有多种药用组分，如虫草多糖、腺苷、甘露醇、虫草素、麦焦甾醇以及必需氨基酸等［3 - 4］，这些物质通常作为保健品以及部分医用药品的成分，因此蝉拟青霉具有滋补强壮、抗疲劳应激、解热镇痛、镇静催眠及降血压等多种药理作用，在研发低成本保健品以及医用药品等领域有较大应用潜力［5 - 9］。

微生物的发酵培养基是菌株产生目标产物的物质基础，发酵环境条件的优化是降低生产成本和提高目标产物含量的基本要求。响应面法( Response Surface Methodology，RSM)是通过分析回归方程解决多变量问题从而确定最优工艺参数的一种统计方法，在微生物培养基组分、酶解条件、食品保藏、发酵过程的优化中均有较广泛的应用［10］。该法相较于优化试验中常采用的单因子法和正交试验，具有能够从整个区域上找到各个因素的最佳组合和响应值的最优值的优点［11］。在最新研究中，张学秋等采用单因素试验和正交试验确定蝉拟青霉最佳发酵培养基为:蔗糖8%、牛肉膏0. 75%、酵母膏0. 125%、Mg SO4 ·7H2 O 0. 3%、KH2 PO4 0. 2%、麸皮0. 5% ，生物量提高1倍［12］。黄小忠等结合单因素试验和正交试验得到蝉花优化后液体培养基:蔗糖40 g / L、蛋白胨15 g / L、KH2 PO4 1. 5 g / L、MgSO4 ·7H2 O 0. 5 g / L， 生物量提高1. 852 g / L［13］。蒋宁等利用响应面法得到蝉花优化后液体培养基:马铃薯200 g / L、葡萄糖 31. 81 g / L、蛋白胨11. 15 g / L、MgSO4 1. 66 g / L，KH2 PO4 1 g / L，生物量提高50%［14］。国外就蝉拟青霉液体培养条件优化研究报道较少。本研究采用响应面法作为培养条件优化方法，在同类研究中具有更显著的生物量提高效果。通过优化液体培养条件，提升蝉拟青霉培养效率，增大其生物量，可为其深入研究提供丰富的试验材料，还可以为其他微生物发酵优化提供理论依据，为蝉拟青霉在医学领域的应用奠定基础。

本文以蝉拟青霉GZDXIFR4606作为发酵菌株， 以发酵条件为自变量，生物量为响应值，采用Plack ett - Burman设计法和Box - Behnken响应面分析法对蝉拟青霉的液体发酵培养条件进行优化。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 试验材料

蝉拟青霉( Paecilomyces cicadae) GZDXIFR4606， 采自云南省墨江的蝉花，由贵州大学真菌资源研究所分离鉴定纯化后斜面低温4 ℃保存。简称为4606，专利编号为CGMCC No. 16485。

1. 1. 2 试剂

马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA购于杭州微生物试剂有限公司;葡萄糖购于成都金山化学试剂有限公司;蛋白胨购于上海盛思生化科技有限公司;酵母浸膏购于上海博微生物科技有限公司;磷酸二氢钾( KH2 PO4 )购于重庆北碚化学试剂厂;无水硫酸镁 ( MgSO4 )购于天津市永大化学试剂有限公司;氢氧化钠( NaOH )购于重庆川江化学试剂厂;氯化氢 ( HCl)购于天津市富宇精细化工有限公司;以上试剂均为分析纯。 

1. 1. 3 仪器

HPD - 150生化培养箱、ZWY - C2112D恒温恒湿智能摇床:常州市华普教学仪器有限公司; GZ - 150 - HSⅡ恒温恒湿箱:韶关市广智科技设备有限公司; BHC - 1300IIA / B2超净工作台:苏州净化设备有限公司; TDZ5 - WS台式低速离心机:湘仪公司; GR60DA灭菌锅:厦门致微仪器有限公司; Exceed - Cc - 24超纯水机:成都艾柯水处理设备有限公司。

1. 1. 4 培养基

①PDA斜面培养基:马铃薯200 g、葡萄糖20 g、 琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL。

②优化前发酵基础培养基:葡萄糖20 g，蛋白胨 3 g，酵母膏2 g，KH2 PO4 1 g，MgSO4 0. 5 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH调整至6. 00。

1. 2 方法

1. 2. 1 菌种活化

基于无菌操作将蝉拟青霉菌种接种于PDA斜面培养基上，25 ℃培养7 d，完成活化。

1. 2. 2 摇瓶种子

用接种环将已活化的斜面菌种接种于装有50 mL最适培养基的150 mL三角瓶中，于25 ℃、150 r / min条件下，振荡培养72 h ～ 96 h。

1. 2. 3 液体发酵培养

待菌体呈球状且均匀分布于锥形瓶中时，将种子按照不同的接种量需求接种到装有150 mL最适培养基的500 mL三角瓶中，于25 ℃、150 r / min条件下，振荡培养72 h ～ 96 h。

1. 2. 4 生物量分析

菌体呈球状均匀分布于锥形瓶中时，将菌丝进行离心，取沉淀物称重。

1. 2. 5 Plackett - Burman试验设计

通过单因素试验确定葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、 KH2 PO4、MgSO4、接种量、pH、温度作为试验影响因子。利用Minitab软件创建Plackett - Burman试验， 将影响蝉拟青霉生物量的8个影响因子分别取高 ( 1)低( - 1)两个水平进行重复数为3次的实验设计，然后比较各因素2个不同水平间的差异和整体的差异以确定各因素对培养条件的显著性［15 - 16］。 用于考察试验误差的各因素所代表的参数和水平见表1，试验设计见表2。 1. 2. 6 最陡爬坡试验设计在PB两水平法基础上得出主要的影响因素有接种量、pH和温度，以这三个因素的变化为爬坡方向进行设计，根据各个因素的试验值变化的梯度方向和步长，逼近最佳值范围［17］。设计试验表及结果见表3，试验重复数为3次。

1. 2. 6 最陡爬坡试验设计

在PB两水平法基础上得出主要的影响因素有接种量、pH和温度，以这三个因素的变化为爬坡方向进行设计，根据各个因素的试验值变化的梯度方向和步长，逼近最佳值范围［17］。设计试验表及结果见表3，试验重复数为3次。验设计表及结果见表4，试验重复数为3次。

1. 2. 8 二次回归模型的检验

通过上述试验得到最优培养条件，在此条件下培养3d后，离心取沉淀称重分析，重复3次，取平均值，与模型预测值进行验证比较［19］。

2 结果与分析

1. 2. 7 Box - Behnken试验设计

对接种量、pH和温度分别取3个水平进行变量分析，其余变量均取平均值，共设计17个点［18］，试验设计表及结果见表4，试验重复数为3次。

1. 2. 8 二次回归模型的检验

通过上述试验得到最优培养条件，在此条件下培养3d后，离心取沉淀称重分析，重复3次，取平均值，与模型预测值进行验证比较［19］。

2. 1 菌体培养

接种于斜面培养基的菌种，菌落由最先的5个点逐渐扩展开铺满试管内斜面，颜色由浅白色渐变为乳白色，最终变为浅黄色，菌丝由紧贴斜面生长转向空中生长，形态由最先的粉末状转为絮状。菌种从固体培养基转接到液体培养基后，菌体数量增加速度由快变缓，均匀分布在培养基中。菌种的形态由肉眼难辨的细小颗粒状逐渐生长为颗粒分明的球状颗粒，颗粒体积增加到一定程度后趋于稳定，培养基颜色由最初的黄褐色转为橙色。培养结果如图1 所示。

2. 2 Plackett - Burman试验

根据表5，可知接种量、pH、温度三个试验影响因素的P值均小于0. 05，可作为可信度较大的试验影响因素进入下一步的优化。

2. 3 最陡爬坡试验

根据表3结果显示，显著影响因素条件组合为: 接种量( 7% )、pH( 6. 00)、温度( 25 ℃ )时，生物量达到最高值207. 590 7 g / L，即最好的试验优化点就在接种量( 7% )、pH( 6. 00)、温度( 25 ℃ )附近。在接下来的试验中，以该条件作为试验因素中心进行试验设计。

2. 4 二次回归模型

利用Design - Expert对Box - Behnken试验结果进行统计分析，可以得到回归方程系数显著性检验结果和方差分析结果，详见表7。

根据表6，模型中的C:温度、AC、A2、B2、C2的P 值均小于0. 050，表明模型的线性、平方对于试验的影响是显著的，但交互影响不显著。根据表7，模拟失拟检验的P值为0. 1929，明显大于0. 050，表明回归模拟没有失拟现象。确定系数R2值为0. 9753，表明模型拟合情况较好，可以对试验结果进行预测。

2. 5 响应曲面的拟合以及最佳条件的确定

基于以上拟合回归方程，通过Design - Expert 进行分析得出响应曲面图。将其中一个因素固定于零水平，研究其余两因素的交互效应，结果见图2、 图3、图4。pH、接种量以及生物量三个变量组成的数据点构成了整个曲面，在曲面的最高点是生物量的最大值，对应的研究因素为该条件下的最佳值。 综合考虑试验的可行性及精确性，最终确定最佳液体培养条件为:葡萄糖20 g / L、蛋白胨3 g / L、酵母膏 2 g / L、KH2 PO4 1 g / L、MgSO4 0. 5 g / L、接种量 6. 65%、pH为6. 00、温度24. 01 ℃。

2. 6 最优条件模型验证试验

为了验证响应面模型的可行性，按照前面所得到的最优液体培养条件下培养3 d后，离心取沉淀称重分析，重复3次，取平均值，得到生物量为239. 475 3 g / L，接近于模型预测值242. 698 7 g / L。 最优条件模型验证结果相较于前的生物量提高了 62. 79%。

3 讨论

碳源是影响蝉拟青霉生长的关键因子，相较于蔗糖和淀粉，葡萄糖对菌种生物量的影响更显著［20］。菌体对葡萄糖和蔗糖更容易吸收，而蔗糖对于生物量的影响程度与葡萄糖非常接近，因为蔗糖具有易分解和来源方便、价格低等优势，所以更适合于工业生产［21］。氮源对蝉拟青霉液体发酵生物量影响较大，其中以蛋白胨和酵母膏为代表，采用蛋白胨和酵母膏(质量比1∶ 1)的复合氮源更有利于生物量积累。而为了让菌种能够更好地生长，保证微生物生长所需的营养元素，同时采用MgSO4和KH2 PO4 作为无机盐组分［22］。有研究发现，以豆粉作为培养基氮源组分更有利于微生物生物量积累，但将其作为基础培养基中的氮源不利于氮源筛选，因此，本试验不予考虑。通过响应面法实现培养条件优化是提高微生物生物量的较优选择，杨光辉等采用响应面法优化毛霉菌B的发酵培养基，使其生物量提高了 32. 41%［23］，蔡水淋等通过响应面法优化蛹虫草的发酵工艺，使其生物量提高了29. 06%［24］，蒋宁等采用响应面法优化蝉拟青霉液体培养基配方，使其生物量提高了50%［14］，本试验中生物量提高了 62. 79% ，与杨光辉、蔡水淋、蒋宁三者实验结果相比较，优化效果更为显著。在采用正交试验优化蝉拟青霉液体培养条件的最新研究结果中，张学秋等采用单因素试验和正交试验获得优化后的培养基使蝉拟青霉生物量提高1倍［12］，黄小忠等结合单因素试验和正交试验使蝉花生物量从2. 959 g / L增加到 4. 811 g / L，提高了62. 59%［13］。本试验在采用更具优势的响应面法基础上，使生物量提高程度与黄小忠等的基本持平，但略低于张学秋等。

在进行菌株的生物量测量时，本试验采取的方法是称量离心沉淀物细胞湿重，而非采用细胞干重法，因此在该过程中，因为人为因素造成的实验误差可能会对试验结果造成一定影响，应该改进。但整体而言，该优化液体培养体系对于提高蝉拟青霉生物量是可行且有效的，这一结果为今后的蝉拟青霉药理活性研究提供了一定的理论基础［25 - 26］，为其他微生物发酵优化提供了方法指导，也为蝉拟青霉今后在医学领域更深层次的应用研究奠定基础，具有一定的现实意义。

4 结论

试验表明多种培养条件会影响蝉拟青霉生物量，并确定了提高蝉拟青霉生物量的最佳摇瓶发酵条件为:葡萄糖20 g / L、蛋白胨3 g / L、酵母膏2 g / L、 KH2 PO4 1 g / L、MgSO4 0. 5 g / L、接种量6. 65%、pH 为6. 00、温度24. 01 ℃。通过响应面法得出的生物量预测值为242. 698 7 g / L，验证试验测得蝉拟青霉生物量平均值为239. 475 3 g / L，与优化前相比其生物量提高了62. 79%。证明优化后的培养体系能有效提高蝉拟青霉生物量。

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