金蝉花质量标准研究

何小翠1 ，李 军2 ，万晶琼2 ，朱益灵1 ，王一姝1 ，欧阳臻1*

 ( 1.江苏大学药学院，江苏镇江 212013; 2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013) 

摘要:目的 建立金蝉花的质量标准。方法 对金蝉花药材进行性状、显微鉴别，采用薄层色谱法进行定性鉴别;参照《中国药典》2015年版方法测定水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量;采用高效液相色谱法同时测定腺嘌呤、尿苷、肌苷、 鸟苷、腺苷、N6 - ( 2 -羟乙基)腺苷6种核苷类成分的含量。结果 金蝉花粉末显微特征明显;薄层色谱斑点清晰，分离度较好; 15批金蝉花药材水分不得超过9. 0% ，总灰分不得超过10. 0% ，酸不溶性灰分不得超过5. 0% ，水溶性浸出物含量不得少于33% ; 6种核苷类成分总含量不得少于0. 26%。结论 该方法稳定可靠，可用于金蝉花的质量控制。

关键词:金蝉花; 质量标准; 核苷类成分; 高效液相色谱法

DOI标识: doi: 10. 3969 / j. issn. 1008-0805. 2021. 05. 32

中图分类号: R284. 1 

文献标识码: A 

文章编号: 1008-0805( 2021) 05-1143-04

Quality standard for Cordyceps cicadae

HE Xiao-cui1 ，LI Jun2 ，WAN Jing-qiong2 ，ZHU Yi-ling1 ，WANG Yi-shu1 ，OU - YANG Zhen1*

( 1. School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China; 2. School of Food and Biologi-cal Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China)

Abstract: Objective To establish the quality standard for Cordyceps cicadae. Methods The characteristic，microscopic and TLC were used for qualitative identification of Cordyceps cicadae. The contents of water，total ash，acid - insoluble ash and extract con tents of Cordyceps cicadae were determined by according to the methods of Chinese Pharmacopoeia in 2015. HPLC was used for the content simultaneous determination of adenine，uridine，inosine，guanosine，adenosine and N6 - ( 2 - hydroxyethyl) adenosine. Results The microscopic characteristics of the powder of Cordyceps cicadae were characteristic. The clear TLC spots exhibited good res olution. The limit of water，total ash，acid - insoluble ash of Cordyceps cicadae must be no more than 9. 0% ，10. 0% ，5. 0% ，re spectively，and the limit of water extract must be no less than 33. 0% . The total content of six nucleosides constituents were no less than 0. 26% . Conclusion This stable and reliable method can be used for the quality control of Cordyceps cicadae.

Key words: Cordyceps cicadae; Quality standard; Nucleosides; HPLC

收稿日期: 2020-08-06; 

修订日期: 2021-03-10 

基金项目:国家重点研发计划项目( 2018YFC1706105) ;中央本级重大增减支专项项目( 2060302)

作者简介:何小翠( 1993-) ，女(汉族) ，安徽铜陵人，江苏大学在读硕士研究生，主要从事中药学研究工作. 

通讯作者简介:欧阳臻( 1964-) ，女(汉族) ，江苏金坛人，江苏大学教授，博士研究生导师，博士学位，主要从事中药活性成分及新药研发工作.

金蝉花为麦角菌科真菌大蝉草Cordyceps cicadae Shing寄生在蝉幼虫上形成的干燥复合物，又名蝉花、蝉茸、蝉虫草、蝉茸菌、虫花等，始载于南北朝《雷公炮炙论》，其性寒、味甘，具有散风热，定惊镇痉等功效，用于治疗风热咳嗽、小儿夜啼、壮热惊悸、手足抽搐等2，广泛分布于我国江苏、浙江、安徽、福建、广东、四川、云南等地。金蝉花中主要含有多糖、核苷、麦角甾醇、甘露醇、环肽、有机酸等多种化学成分[，具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老及保护肾脏等作用-1。目前，历版《中国药典》尚未收载金蝉花，2008年版《上海市中药饮片炮制规范》、2010年版《四川省中药材标准》和2015年版《浙江省中药炮制》虽有收载，但其质量控制指标仅有性状鉴别项和检查项，尚无显微鉴别、薄层鉴别、含量测定等项目-3。关于金蝉花的现有研究也主要集中在化学成分及药理作用，未对其进行系统的质量标准研究。因此，本实验对15批金蝉花药材进行性状、显微鉴别，TLC定性鉴别，测定水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物含量，并建立HPLC法同时测定腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷、N-(2-羟乙基)腺苷6种核苷类成分含量，制订金蝉花药材的质量标准，为该药材的质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1仪器

OLYMPUS显微镜(日本Nikon公司);Agilent-1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);HC-150T2高速粉碎机(永康市绿可食品机械有限公司);BSA124S分析电子天平(上海精密科学仪器有限公司);HH-S2数显恒温水浴锅(江苏金坛市医疗仪器厂);ZF-250B超声波清洗器(上海致丰电子科技有限公司);DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司);SG-XL1100马弗炉(上海一恒科技有限公司);B-490旋转蒸发仪(瑞士步琪有限公司);SHB-3循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

1.2 试药 

对照品腺嘌呤(批号LA170651，纯度≥98%)、尿苷(批号NU20170329,纯度≥98%)、肌苷(批号JI191220，纯度≥98%)、鸟苷(批号LG191201，纯度≥98%)、腺苷(批号LG191220，纯度≥98%)均购自合肥博美生物科技有限公司;N6-(2-羟乙基)腺苷购自南京满林生物医药科技有限公司;甲醇(色谱纯，江苏汉邦科技有限公司);其他试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司);水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈百立食品有限公司)。

1.3 药材

15批金蝉花样品，经江苏大学药学院欧阳臻教授鉴定为麦角菌科真菌大蝉草Cordyceps cicadae Shing寄生在蝉幼虫上形成的干燥复合物，具体信息见表1。

2 方法与结果

2.1 性状鉴别

本品由虫体与从虫头部长出的真菌孢梗束或子座相连而成。虫体形似蝉蜕，长椭圆形，微弯曲，长3~4cm，直径1~1.5cm。表面灰褐色或棕黄色，大部分被有灰白色菌丝。断面白色或黄白色，质松软。头部隐约可见眼及口器，胸腹间两侧具有一对翅芽，下侧有2对足，背面有环节，尾短尖。头部有数枚树枝状子座体，子座呈细长圆柱形，分枝或不分枝，长2~6cm，直径1~4mm。具有多数细小点状突起，顶端稍膨大，灰褐色或灰白色，质脆易断。气微，味淡。见图1。

2.2 显微鉴别

本品粉末黄棕色或黄白色。菌丝管状，分隔，壁光滑，无色透明，粗2.0~3.0um，多弯曲成团，少数平行成束密集排列;气管壁组织呈不规则碎块状，白色，可见整齐条状增厚壁，排列成栅栏状;刚毛黄棕色或黄白色，呈细刺状，多已断裂;体壁碎片黄色或黄棕色，其上着生短粗刚毛，先端锐尖或钝圆，常可见刚毛脱落后形成的圆形毛窝;少数散落的油滴，无色。见图2。

2.3 薄层色谱鉴别

称取金蝉花粉末(过3号筛)0.5g，加90%甲醇10mL,超声(功率300W，频率40kHz)处理30min，放冷，滤过，滤液浓缩至干，加2mL90%甲醇溶解，作为供试品溶液。另取腺嘌呤、肌苷、鸟苷、尿苷、腺苷、N-(2-羟乙基)腺苷对照品各适量，精密称定，加90%甲醇配制成每1mL各含0.05mg的溶液，作为对照品溶液”。照薄层色谱法(《中国药典》2015版四部通则0502)试验5，吸取供试品溶液2uL，对照品溶液1uL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以氯仿-丙酮-甲醇-浓氨水(8:3:4:0.9)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯254nm下检视，结果见图3。由图3可知，供试品与对照品色谱位置一致，显相同颜色的荧光淬灭斑点。

2.4 检查项及浸出物

2.4.1 水分

按照《中国药典》2015年版四部通则0832项下水分测定法中第二法(烘干法)进行测定[，结果见表2。15批金蝉花药材水分测定结果为5.25%~8.35%，平均含量为7.39%，按平均含量上浮20%制定标准，拟定金蝉花药材水分含量不得超过9.0%。

2.4.2 总灰分

按照《中国药典》2015年版四部通则2302项下总灰分测定法进行测定，结果见表2。15批金蝉花药材总灰分测定结果为4.53%~10.52%，平均含量为7.28%，按平均含量上浮20%制定标准，并结合实验结果，拟定金蝉花药材总灰分含量不得超过10.0%。

2.4.3 酸不溶性灰分

按照《中国药典》2015年版四部通则2302项下酸不溶性灰分测定法进行测定，结果见表2。15批金蝉花药材酸不溶性灰分测定结果为1. 45% ～ 6. 34% ，平均含量为 3. 54% ，按平均含量上浮20%制定标准，拟定金蝉花药材酸不溶性灰分含量不得超过5. 0%。

2.4.4 浸出物

按照《中国药典》2015年版四部通则2201项下水溶性浸出物测定法(热浸法)进行测定，结果见表2。15批金蝉花药材水溶性浸出物测定结果为35.96%~46.28%，平均含量为41.71%，按平均含量下调20%制定标准，拟定金蝉花药材水溶性浸出物含量不得少于33.0%。

2.5含量测定

2.5.1 色谱条件 

Supersil AQ-C1g (250 mm x4.6 mm,5 m)色谱柱和ODS3预柱(10mmx4.6mm,5m);流动相甲醇(A)-水( B) ，梯度洗脱( 0 ～ 4 min，0% A; 4 ～ 15 min，0 ～ 5% A; 15 ～ 20 min，5 ～ 10% A; 20 ～ 30 min，10 ～ 15% A; 30 ～ 35 min，15 ～ 20% A; 35 ～ 40 min，20% A) ;检测波长260 nm;体积流量1. 0 mL / min;柱温25 ℃ ;进样量10 μL。色谱图见图4。

2.5.2 对照品溶液的制备

精密称取各对照品适量，加超纯水制成腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和N-(2-羟乙基)腺苷浓度分别为 0. 123 mg/mL、1. 022 mg/mL、0.214 mg/mL、0. 526mg/mL、0.824 mg/mL和1.635 mg/mL的混合对照品溶液，即得。2.5.3 供试品溶液的制备取金蝉花粉末约0.5g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入超纯水5mL，密塞，摇匀，称定重量,超声处理(功率300W，频率40kHz,20°C以下)30min,10000r/min离心10min,分离上清液，药渣同法再超声提取1次，合并上清液，定容至10mL,摇匀，0.45um微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.5.4 线性关系考察

精密吸取"2.5.2"项下对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mL，分别置1mL容量瓶中，加超纯水至刻度，稀释成系列质量浓度溶液，摇匀，在“2.5.1”项色谱条件下测定。以对照品质量浓度(g/mL)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷、N-(2-羟乙基)腺苷回归方程及相关系数。结果见表3，表明6种核苷类成分在各自线性范围内呈良好的线性关系。

2. 5. 5 精密度试验

取同一批金蝉花粉末( S12) ，精密称定，按 “2. 5. 3”项下方法制备供试品溶液，按“2. 5. 1”项色谱条件连续进样6次，测得腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷、N6 - ( 2 -羟乙基)腺苷峰面积RSD分别为1. 08%、0. 39%、2. 41%、0. 46%、 2. 79%、1. 34% ，表明仪器精密度良好。

2. 5. 6 重复性试验

取同一批金蝉花粉末( S12) 6份，精密称定， 按“2. 5. 3”项下方法制备供试品溶液，按“2. 5. 1”项色谱条件测定，测得腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷、N6 - ( 2 -羟乙基)腺苷峰面积RSD分别为1. 82%、0. 83%、1. 92%、1. 77%、2. 74%、 1. 11% ，表明该方法重复性良好。

2. 5. 7 稳定性试验

取同一批金蝉花粉末( S12) ，精密称定，按 “2. 5. 3”项下方法制备供试品溶液，按“2. 5. 1”项色谱条件，分别于 0、2、4、8、12、24 h测定，测得腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷、N6 - ( 2 -羟乙基)腺苷峰面积RSD分别为1. 47%、2. 14%、2. 27%、 1. 79%、2. 88%、0. 93% ，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。 

2. 5. 8 加样回收率试验

取已知含量的金蝉花粉末( S12)约0. 25 g，共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入对照品适量，按 “2. 5. 3”项下方法制备供试品溶液，按“2. 5. 1”项色谱条件测定， 计算加样回收率，结果见表4。

2.5.9 样品含量测定

分别取15批金蝉花粉末约0.5g,按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液,按"2.5.1”项色谱条件测定,记录色谱峰峰面积，按干燥品计算6种核苷类成分的含量，结果见表4。6种核苷类成分平均总含量为3.27mg/g(0.33%),但不同产地含量差异较大，故按平均含量下调20%制定标准，建议金蝉花中6种核苷类成分总含量不得少于0.26%。含量测定结果见表5。

3 讨论

3. 1 薄层色谱鉴别

本实验参考相关文献［14，17］考察了氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨水( 8∶ 3∶ 3∶ 3∶ 0. 9)、氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-水-氨水( 8∶ 2∶ 6∶ 0. 2∶ 0. 3)、氯仿-丙酮 -甲醇-浓氨水( 8∶ 3∶ 4∶ 0. 9)等展开系统，发现以氯仿-丙酮-甲醇-浓氨水( 8∶ 3 ∶ 4 ∶ 0. 9)为展开剂时样品分离度较好、斑点清晰。同时，还考察了提取方法(回流提取法、超声法) 对展开效果的影响，发现超声提取所得样品简便易行、分离效果较好、斑点清晰。

3.2 浸出物含量测定

本实验以水为提取溶剂考察了冷浸法和热浸法对浸出物含量的影响，发现热浸法测得的浸出物含量较高。同时，还考察了不同提取溶剂水、稀乙醇、乙醇对浸出物含量的影响，发现以水为溶剂测得的浸出物含量最高。因此，选择热浸法测定水溶性浸出物含量。

3.3 HPLC色谱条件优化

本实验参考相关文献.1考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%醋酸溶液等流动相，发现以甲醇-水为流动相时峰形良好，分离效果最好;同时还考察了柱温(20、25、30°C)、体积流量(0.5、0.8、1.0mL/min)对分离效果的影响，发现25°C、1.0mL/min时色谱峰分离度、峰形较好，因此，本实验最终选择“2.5.1”项下色谱条件。

3.4含量测定

核苷类成分是虫草类药材的主要功效成分，具有抗肿瘤、抗衰老、抗菌和抗病毒等多种生理活性。腺嘌呤具有刺激白细胞增生的作用，用于肿瘤放射、化疗治疗等引起的白细胞减少症;尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷等对人体的免疫、神经、心血管等系统都发挥着重大的作用2·22;N-(2-羟乙基)腺苷具有抗肿瘤、降低炎症反应、保护肾脏、镇定和镇痛等作用·9。金蝉花与冬虫夏草的无性型同属，2015年版《中国药典》只收载了冬虫夏草腺苷的HPLC含量测定方法，质量评价指标较为单一，本实验选择金蝉花中含量较高的腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷、N-(2-羟乙基)腺苷等6种核苷类成分作为含量测定的指标性成分。参考《中国药典》中其它具有多种有效成分药材的标准制定方法，建议以6种核苷类成分总含量为限量指标制定金蝉花标准。

参考文献:

［1］王 琼，王春雷，何福根，等.地方药材金蝉花的研究进展［J］.肿瘤学杂志，2013，19( 3) : 227.

［2］ 万永红，蔡开明，韦 曙.蝉花的本草考证与生物学研究［J］.江苏林业科技，2013，40( 3) : 50.

［3］ 宋 斌，林群英，李泰辉，等.中国虫草属已知种类及其分布［J］.菌物研究，2006，4( 4) : 10.

［4］葛 飞，夏成润，李春如，等.蝉拟青霉菌丝体与天然蝉花中化学成分的比较分析［J］.菌物学报，2007，26( 1) : 68.

［5］ Chu ZB，Chang J，Zhu Y，et al. Chemical constituents of cordyceps cica-dae ( Article) ［J］. Nat Prod Commun，2015，10( 12) : 2145.

［6］宋佳敏，王鸿飞，罗 洁，等.金蝉花多糖对小鼠免疫功能的影响［J］.核农学报，2018，32( 10) : 1977.

［7］ Wang H，Zhang J，Sit W H，et al. Cordyceps cicadae induces G2 / M cell cycle arrest in MHCC97H human hepatocellular carcinoma cells: a proteomic study［J］. Chin Med，2014，9( 1) : 15.

［8］封 燕，贡小辉，韦德群，等.金蝉花多糖的抗氧化活性及结构分析［J］.食品科学，2016，37( 13) : 19.

［9］杨介钻，金丽琴，吕建新，等.蝉拟青霉多糖抗衰老作用的实验研究［J］.中国老年学杂志，2004，24( 4) : 343.

［10］温 萍，陈盛铎，郑 兵，等.金蝉花多糖对D - GlaN致小鼠急性肝损伤的保护作用及机制［J］.中国实验方剂学杂志，2018，24 ( 6 ) :108.

［11］海市食品药品监督管理局.上海市中药饮片炮制规范［S］.上海:上海科学技术出版社，2008: 449.

［12］四川省食品药品监督管理局.四川省中药材标准［S］.成都:四川科学技术出版社，2010: 659.

［13］浙江省食品药品监督管理局.浙江省中药炮制［S］.浙江科学技术出版社，2005: 360.

  [14]   宋 健，王 平，张会敏.人工培养北虫草与野生冬虫夏草的生药学对比研究[].中药材,2018,41(5):1070.

  [15] 国家药典委员会.中国药典，四部[S].北京:中国医药科技出版社，2015:58.化［J］.中成药，2017，39( 8) : 1612.

  [16] 李 玲，梁瀚文，王玉芹，等.金蝉花中5种核苷超声提取工艺的优

［17］国家药典委员会.中国药典，一部［J］.北京:中国医药科技出版社，2015: 1073.

［18］葛 琦，万晶琼，朱益灵，等.金蝉花核苷类成分的LC - MS定性分析与HPLC含量测定［J］.天然产物研究与开发，2019，31 ( 11 ) :1857.

［19］李 玲，梁瀚文，吴卓娜，等.聚类分析和主成分分析法研究金蝉花不同部位的HPLC指纹图谱［J］.时珍国医国药，2017，28 ( 7 ) :1537.

［20］张英琪.维生素B4(腺嘌呤)通过cAMP / PKA通路上调铁调素的表达减轻小鼠铁过载［D］.浙江大学博士学位论文，2017: 48.

［21］张雪梅，杨丰庆，夏之宁.食品中核苷类成分的药理作用研究进展［J］.食品科学，2012，33( 9) : 277.

［22］丁兴杰，熊 亮，周勤梅，等.天然核苷类成分的化学结构和药理活性研究进展［J］.成都中医药大学学报，2018，41( 2) : 102.

［23］刘宽博，王 芬，柴一秋，等.广义虫草类真菌来源的N6 ‐( 2 ‐羟乙基)腺苷的研究开发现状与思考［J］.菌物学报，2017，36( 1) : 6.